Différentes stratégies conduisent à l’émergence de sous-populations bactériennes in vivo

Une stratégie de "bet hedging" (voir « Réponse immunitaire de l’insecte et impact du complexe némato-bactérien ») est mise en œuvre chez Photorhabdus pour constituer un mélange de sous-populations préexistantes qui assurent l'hétérogénéité de la résistance aux peptides antimicrobiens (PAMs). Certaines cellules sont sensibles aux PAMs alors que d’autres sont pré-adaptées pour leur résister, assurant ainsi la survie bactérienne dans l’environnement hostile que constitue l’hémolymphe de l’insecte et donc le succès de l’infection (Mouammine et al, 2017).

Alors que de nombreuses publications décrivent les facteurs bactériens impliqués dans les étapes précoces de l’infection chez l’insecte, très peu de données sont disponibles pour déchiffrer ce qui se passe dans le cadavre après la mort de l'insecte. Xenorhabdus et Photorhabdus isolés des nématodes sont typiquement décrits comme appartenant à un état phénotypique dit « primaire ». Cependant, dans toutes les espèces de symbiotes des deux genres de Xenorhabdus et Photorhabdus, des variants apparaissent lorsqu'ils atteignent la phase stationnaire avancée dans les milieux de culture et dans les cadavres d'insectes. Ainsi, une partie de la population bactérienne se convertit en formes dites « secondaires » (ou variant 2), voire « tertiaires » chez Xenorhabdus (Figure 1). En collaboration avec J.-B. Ferdy (Univ. Toulouse), nous avons montré que le variant 2 de Xenorhabdus est en fait un mutant dans un régulateur transcriptionnel global (Lrp). Une survie élevée (dite « GASP » pour Growth advantage in stationary-phase) a été observée chez ces variants pendant la phase stationnaire avancée expliquant pourquoi ils atteignent une charge élevée pendant les infections tardives. Cependant, l'impact des variants sur la fitness du système global (mesurée par le nombre de nématodes produits après l'émergence) est faible. Notre hypothèse est que l’existence de ces variants permet à Xenorhabdus d’élaborer une stratégie de « division du travail » (Cambon et al, 2019).

Figure 1. Scénario de sélection des variants dits « GASP » dans des cultures discontinues à long terme et au cours du cycle de vie de X. nematophila. (A) Croissance bactérienne au cours de l'infection. (B) Étapes clés du cycle de vie de X. nematophila. A partir de 3 jours post-infection (dpi), les variants GASP (mutants lrp du groupe 2 en rouge et du groupe 3 en vert) sont détectés et augmentent rapidement en fréquence car ils résistent mieux aux conditions de la phase stationnaire que les variants primaires (en bleu). Lorsque les nématodes commencent à se disperser vers 10 à 15 jours post-infection, la population de X. nematophila dans le cadavre de l'hôte peut comprendre une forte proportion de variants GASP. En principe, les variants GASP, pourraient donc contribuer à la transmission. Cependant, nos données suggèrent que les nématodes qui portent des variants GASP ont une probabilité plus faible de réussir à infecter de nouveaux insectes (Cambon et al, 2019).

De l'hétérogénéité phénotypique à la méthylomique

Pour rechercher l'origine mécanistique de l'émergence de sous-populations, nous avons également étudié les phénomènes épigénétiques liés à l'état de la méthylation du génome (méthylome). La méthylation de l'ADN peut provoquer des différences dans l'expression de certains gènes, notamment ceux codant pour des facteurs impliqués dans les interactions hôte-bactéries. En raison de la compétition entre les protéines régulatrices et les méthyltransférases pour l'accès aux sites consensus des promoteurs, l'expression des gènes varie en fonction de l'état de méthylation de l'adénine ou de la cytosine des séquences promotrices. Un outil puissant (le séquençage SMRT pour Single Molecule Real-Time) sans étape d'amplification de l'ADN a été récemment développé pour caractériser le méthylome. Avec des collaborateurs du LIPM (INRAE, Toulouse), nous avons réalisé la première description du méthylome d'une bactérie entomopathogène (Payelleville et al, 2018). Nous avons :

• Identifié un taux élevé de méthylation de l'ADN qui était stable au cours de la croissance.
• Montré que l'émergence de la sous-population résistante aux PAMs n'était pas due à la méthylation de l'ADN.
• Mis en évidence l’existence de régions non méthylées dans certains promoteurs (Figure 2).
• Montré que la surexpression de la méthyltransférase Dam chez Photorhabdus entraîne une diminution significative de la motilité (sous-expression des gènes flagellaires) et de la virulence après injection dans des larves de lépidoptères de Spodoptera littoralis (Payelleville et al, 2017).

Figure 2. Premier méthylome d’une bactérie entomopathogène. Nous avons déterminé que la méthylation du génome de Photorhabdus est stable aux différentes phases de croissance testées. Ce travail apporte des informations clés sur les méthylomes bactériens en montrant que certains loci ne sont pas méthylés par la méthylase Dam et encourage donc à la poursuite des recherches pour découvrir les régulateurs transcriptionnels protégeant ces loci de la méthylation de l'ADN (Payelleville et al, 2018).

Enfin, en collaboration avec le laboratoire de D. Clarke (Cork University, Irland), nous avons évalué l'impact de la méthylation sur la relation mutualiste entre Photorhabdus et le nématode. Alors qu’aucune différence dans la quantité de juvéniles infectieux (IJs pour infective juveniles) émergeant du cadavre n'a été observée entre les deux souches, une augmentation significative de la TL₅₀ (temps nécessaire pour tuer 50% des insectes) apparait lors de l'infestation des insectes par les IJs associés à la souche surexprimant la méthyltransférase (Payelleville et al, 2019). Ces résultats confirment que la méthyltransférase Dam de Photorhabdus joue un rôle dans la pathogénicité du complexe nématobactérien.

Bibliographie

Cambon, M.C., Parthuisot, N., Pages, S., Lanois, A., Givaudan, A., Ferdy, J.-B. 2019. Selection of bacterial mutants in late infections: when vector transmission trades off against growth advantage in stationary phase. mBio 10, 1-14. DOI : 10.1128/mBio.01437-19.

Mouammine, A., Pages, S., Lanois Nouri, A., Gaudriault, S., Jubelin, G., Bonabaud, M., et al. 2017. An antimicrobial peptide-resistant minor subpopulation of Photorhabdus luminescens is responsible for virulence. Sci Rep 7, 43670. DOI : 10.1038/srep43670.

Payelleville, A., Lanois, A., Gislard, M., Dubois, E., Roche, D., Cruveiller, S., et al. 2017. DNA adenine methyltransferase (Dam) overexpression impairs Photorhabdus luminescens motility and virulence. Front Microbiol 8, 14 p. DOI : 10.3389/fmicb.2017.01671.

Payelleville, A., Legrand, L., Ogier, J.-C., Roques, C., Roulet, A., Bouchez, O., et al. 2018. The complete methylome of an entomopathogenic bacterium reveals the existence of loci with unmethylated Adenines. Sci Rep 8, 1-14. DOI : 10.1038/s41598-018-30620-5.

Payelleville, A., Blackburn, D., Lanois, A., Pages, S., C Cambon, M., Ginibre , N., et al. 2019. Role of the Photorhabdus Dam methyltransferase during interactions with its invertebrate hosts. PLoS One 14, 14 p. DOI : 10.1371/journal.pone.0212655.